胶质细胞瘤和血脑屏障模型的生物原材料和三维生物复印对策
2020-12-27
近日,英国UCSD的ChenShaochen专家教授等在AdvancedMaterials刊物上具体描述了“Biomaterialsand三维BioprintingStrategiestoModelGlioblastomaandtheBlood–BrainBarrier”,详解了胶质细胞瘤和血脑屏障模型的生物

近日,英国UCSD的ChenShaochen专家教授等在AdvancedMaterials刊物上具体描述了“Biomaterialsand三维BioprintingStrategiestoModelGlioblastomaandtheBlood–BrainBarrier”,详解了胶质细胞瘤和血脑屏障模型的生物原材料和三维生物复印对策。引言:胶原纤维母细胞瘤(GBM)是最时兴和致命性的成年人继发性神经中枢系统软件癌病。免疫抑制性和高宽比异方差性的肿瘤微自然环境,根据血脑屏障(BBB)限定有机化学治疗法或免疫治疗的寄送及其人的大脑与众不同的生物化学和人体解剖学特点造成 其广泛发作和欠佳愈后。因为传统式模型没法预测分析GBM的功效,因而GBM和BBB的身体之外三维模型根据三维生物复印技术性运用病人或身心健康个人来源于的细胞和生物原材料,很有可能会效仿GBM和BBB的基础生理学和病理学特点。三维生物复印搭建物可以以种群搭配,高通量测序和可重现的方法科学研究细胞及其细胞与细胞外栽培基质的相互作用,作为挑选或给药服务平台。这儿,出示了当今三维生物复印的GBM和BBB模型的简述,详解了GBM和BBB的微自然环境构成,仿真模拟纯天然机构的有关生物原材料及其完成模型生产制造的生物复印对策。总得来说,三维生物复印的GBM和BBB模型是有期待的系统软件和仿生技术代替品,可取代传统式模型,以开展更靠谱的原理科学研究和临床医学前药物筛选,最后很有可能会加速GBM的药品开发设计全过程。

情况胶原纤维母细胞瘤(GBM)是最普遍和攻击性的成年人继发性脑癌,占全部恶变神经中枢系统软件(CNS)肿瘤的%。在国外,病人的五年相对性成活率为%,在全部继发性恶变神经中枢系统软件肿瘤中排行最少。虽然过去的几十年中投入了极大的勤奋,但针对GBM摧残的病人来讲,其医治进度微乎其微。保养规范GBM的医治包含较大 水平的手术治疗安全性摘除,随后另外内服甲基化剂,替莫唑胺(TMZ)和輔助TMZ开展有机化学放化疗。之前试着过应用半脑部手术开展完全的手术治疗摘除,但因为肿瘤细胞外扩散入侵脑内并保存必需的脑作用,因而无法痊愈。GBM细胞以不一样的方法入侵脑本质,包含做为单独细胞,并当做发作的储备库。GBM的普遍分子结构谱分析已评定出体现异质性肿瘤细胞生物学和表观遗传学的与众不同基因表达亚型。TME中的肿瘤细胞,栽培基质细胞和细胞外栽培基质(ECM)中间繁杂的细胞和细胞-栽培基质相互作用,造成 动态性和免疫抑制性GBM肿瘤生态体系对目前治疗法具备高宽比抵抗能力。广泛发作,较高的肿瘤内和肿瘤间异方差性及其反复性GBM对医治的抗药性造成 七十岁下列(个月)的病人愈后较弱,负相关存活時间不高。与别的实体肿瘤对比,将治疗剂传至GBM肿瘤尤其具备趣味性,由于药品和细胞根据人的大脑与众不同的毛细血管天然屏障血脑屏障(BBB)的运送受限制。BBB当做循环系统血夜和脑本质中间的天然屏障,以避免 血液传播的病原菌或有毒物质进到神经中枢系统软件并保持神经中枢系统软件的恒定。BBB清除了98%之上的小分子药物,并严苛调整淋巴结细胞的渗漏,进而限定了有机化学治疗法和效用T细胞在GBM机构中的累积。BBB的调整或阻碍的避开推动了一些脑肿瘤医治,这说明多功能性BBB的存有针对精确评定GBM医治很有可能尤为重要。在再运用FDA准许的癌症药物具备提高的BBB渗入的GBM医治越来越大的兴趣爱好也说明BBB的GBM功效的潜在性功效。当今GBM医治发展趋势的短板说明了当今建模方法的局限,并适用开发设计更靠谱的模型系统软件,以协助表明涉及到不一样亚型的方式,并出示其他信息丰富多彩的临床医学前药品评定,以加快药品开发设计全过程。

GBM模型不但必须归纳动态性的多组分TME,并且还必须人的大脑在GBM病发原理和医治反映中起主导作用的与众不同的解剖学和生物化学特点。传统式的模型方法复建GBM关键层面的能力有限,比如有关的肿瘤-栽培基质相互作用和TME异方差性,或是因为欠缺BBB天然屏障和与肿瘤发展趋势,药品有关的人的大脑别的特点而没法靠谱地评定疗法透水性和治疗效果。病人来源于的不一样的移植物(PDX)保存了肾源肿瘤的很多转录组和基因特点,并出示了有利于细胞生长发育的饱含ECM的微自然环境。殊不知,造成PDX必须应用免疫缺陷的小动物,这阻拦了对有关免疫反应的科学研究,比如GBM细胞与肿瘤有关的小胶质细胞和巨噬细胞(TAM)中间的相互作用。TAM占反复性GBM大约三分之一的肿瘤块,并调整各种各样癌病主题活动,比如肿瘤细胞转移,侵蚀和抗药性。PDX的开发设计也很用时,而且扩散系数相对性较低,因而必须周期时间,不适感用以进度快速的GBM等病症。以可再现,高效率和高通量测序的方法简述GBM的纯天然肿瘤-栽培基质相互作用和GBM的细胞-ECM相互作用的身体之外模型可能是身体模型的更强取代方式。3D细胞塑造是最普遍且可浏览的身体之外建模方法,但他们欠缺适度的规格及其对GBM开发设计尤为重要的细胞-ECM相互作用。3D塑造标准还会继续诱发塑造细胞的基因的表达,细胞形状和细胞特异性产生不可逆更改,进而减少了他们与原发性肿瘤的相似度。Transwell系统软件已用以探寻肿瘤发展趋势,细胞依赖感及其BBB保持和溶解中的细胞相互作用。殊不知,转孔膜不可以归纳在转孔塑造BBB的缝隙连接的变化规律,和细胞的固定不动直径历经燃气表变化,因为在3D塑造标准和欠缺与ECM适度的相互作用。与别的身体之外塑造方式对比,类器官是三维身体之外模型,具备仿生技术实际效果。GBM类器官能够更好地维持了继发性肿瘤的细胞异方差性和基因的表达,而且类器官中的肿瘤细胞与3D类对比主要表现出提高的乏氧情况和偏干。类器官生产制造协议书已被开发设计,但类器官中的基因变异和细胞机构的因为自组装全过程限定其更普遍的运用类器官内的比较有限的操纵。在以可再现和可拓展的方法归纳高宽比异质性的GBM微自然环境或生理学有关的BBB天然屏障特点层面,传统式的身体之外建模方法依然受限制。

优秀的生物生产加工技术性能够形成具备优良协调能力,精确性和可扩展性的订制三维机构模型,进而解决了别的模型方法的很多局限。可依据设备制造后是不是将细胞成份栽种到搭建体上或在生产制造过程中将其封裝在生物原材料中对生物生产技术开展归类。与细胞栽种方式对比,细胞包裹方式能够能够更好地操纵堆积细胞和分子结构的总数和部位,进而完成更强的再现性。封裝在凝胶剂中的细胞会从每个方位碰到ECM提醒,类似他们的生理学情况,而打疫苗细胞则关键从与凝胶剂触碰的一侧接受ECM提醒。很多技术性可以生产制造具备高像素和高通量测序的无细胞支撑架或机器设备,比如电纺,熔化堆积模型和可选择性激光器煅烧等,但并不广泛用以细胞封裝目地。三维生物复印早已出現,以推动其在生物原材料中以优良的生存力封裝细胞并精准操纵组织架构和栽培基质特点的工作能力,进而促进了癌病和机构模型行业的发展趋势。三维生物复印可建立可再现的人性化模型,使其尤其适用对肿瘤内和病人间异方差性较高的病症如GBM开展模型。生物复印技术性的运用不但仅限于活物机构,还包含无细胞支撑架,微液体设备和可嵌入构造。动态性的,微液体的BBB模型早已根据生物复印科研开发,该模型根据层.流出示了对天然屏障作用尤为重要的剪应力。

在这儿,大家回望了三维生物复印GBM和BBB模型的设计方案和生产制造层面的最新消息。大家最先出示GBM和BBB中小型自然环境构成的深入分析,关键是细胞和ECM的成份和特性。接下去,大家详细介绍用以完成认知模型的2个关键专用工具:1)已用以生物运用的三维生物复印对策,并简述了其原理,优势,局限和运用,及其2)有关生物原材料以及衍生物。随后,大家将回望应用三维生物复印和生物原材料搭建GBM和BBB模型的当今科学研究,这种模型已证实与传统式模型对比具备生理学有关的特点和改善的作用。最终,大家探讨了GBM药品开发设计的挑戰和未来前景。

GBM和BBB微自然环境

这节出示了纯天然机构的层次信息内容:纯天然机构的构成部分,即细胞和ECM构成;基础构成部分的拼装和机构;及其拼装造成的微自然环境的生物物理学或生物化学特点。

细胞构成与作用在GBM和BBB微自然环境中,细胞构成,作用及其与别的细胞的相互作用已获得普遍科学研究和核查。在这儿,大家出示了一个简易的详细介绍,详细介绍了基础的细胞成份和她们的人物角色。

GBM的细胞一部分GBMTME由不一样的细胞人群构成(图1)。GBMTME中的关键非新板质间细胞包含TAM,小胶质细胞,星型胶质细胞,神经细胞,间充质干细胞(MSC)和毛细血管周细胞。在GBM的萎缩地区,高达30–50%的肿瘤块由具备M2肿瘤燃气表的TAM构成。M2燃气表具备抗感染功效,可造成能抑制肿瘤生长发育的免疫抑制性TME。因为损伤的血脑屏障和脑恒定的振荡,循环系统单核心细胞衍化的巨噬细胞被募资到GBM位置,而小胶质细胞则是神经中枢系统软件停留的免疫系统细胞,可回应肿瘤的案件线索而被激话。这种免疫系统成份根据上涨MMP-2和MMP-9等栽培基质金属材料胰蛋白酶(MMP)来推动肿瘤侵蚀。星型胶质细胞能够根据多种多样通信方式被肿瘤细胞募资并激话,包含细胞外囊泡和直排转运蛋白。肿瘤有关的反映性星型胶质细胞推动CD133呈阳性胶原纤维母细胞瘤干细胞(GSC)的侵蚀,并代谢抗感染细胞因素(如TGFβ)抑止抗肿瘤免疫反应,进而造成整体免疫抑制性GBM微自然环境。肿瘤细胞和神经细胞中间的神经递质磷酸能推动通讯GBM生长发育和侵蚀,并在GBM别的神经细胞功效已被归功于自代谢数据信号和旁分泌数据信号。MSC也是GSC生态因子中的关键栽培基质成份,可推动间充质肿瘤基因表达情况并根据白介素6和含miRNA-1587的外界体受体肿瘤繁衍。

赘天性肿瘤细胞并不是同质性物种。单细胞组学科学研究确认了多种多样细胞情况,包含类干细胞GSC,他们可推动肿瘤的产生,医治抗药性及其医治后的再生长发育。GBM细胞漫入侵到脑本质,清除彻底手术治疗摘除。粘附分子,包含CD44和玻尿酸受体的健身运动(RHAMM)蛋白激酶,在GBM细胞的细胞表层表述,进而提高了黏附性和顺着饱含玻尿酸(HA)的脑ECM的转移。[38]肿瘤细胞重构部分ECM,以根据代谢多种多样胰蛋白酶(比如MMP和纤溶酶原激活物(PAs))帮助侵入。GBM非常少在CNS外迁移,提醒肿瘤细胞早已融入了与众不同的CNS微自然环境。BBB的细胞成份BBB的细胞成份包含脑毛细血管表皮细胞(BMEC),周细胞,星型胶质细胞和神经细胞,他们相互产生了CNS的多功能性神经系统毛细血管企业(图2)。毛细血管里层的BMEC是高宽比电极化的表皮细胞,其特点是持续缝隙连接,黏附联接和比较有限的胞吞功效。连接蛋白一氧化氮合酶出示了阻拦分子结构旁细胞外扩散的物理学天然屏障,缝隙连接的高电阻器阻拦了感应起电分子结构的进到。BBB特殊的注入转运蛋白(包含物质的量浓度载体蛋白)和直排转运蛋白(包含ATP融合盒(ABC)大家族组员)能够消化吸收营养成分到CNS中,并依照浓度梯度除去化学物质。直排转运蛋白,比如ABCB1,ABCG2和与多药抗药性有关的蛋白质,从神经中枢系统软件中去除开治疗剂,进而将其浓度值减少至亚医治水准。周细胞是壁细胞包埋在毛细血管的质膜。周细胞参加了血脑屏障的很多作用,调整表皮细胞缝隙连接的产生和星型胶质细胞的尾足电极化。较低的周细胞普及率或欠缺周细胞可提升BBB的渗透性。星型胶质细胞根据沿血管壁的尾端脚壁与毛细血管相互作用。星型胶质细胞调整BBB外扩散天然屏障特点,针对损害后BBB恢复尤为重要。BMECs,周细胞和星型胶质细胞生成大部分BBB-特殊ECM蛋白质。神经细胞根据神经细胞主题活动和脑源性神经系统营养成分因素(BDNF)等细胞生长因子的释放出来来调整BBB的渗透性。在炎症性标准下,人的大脑中的小胶质细胞向大心脑血管转移,并在血脑屏障一致性中起多种多样功效。虽然小胶质细胞的CCR5依赖感转移最开始可保持BBB一致性,但不断的发炎会造成 星型胶质细胞吞食末梢神经吞食,进而危害BBB一致性。激话的小胶质细胞代谢促炎分子结构,毁坏了血脑屏障。尽管BBB在GBM中存有地区缺点,尤其是在萎缩的肿瘤关键周边,但BBB在与周边脑本质触碰的肿瘤的增长和侵蚀边沿基本上维持详细。脑本质,GBM和BBB的ECM构成ECM调整很多大脑神经,BBB天然屏障特点及其GBM的起止,发展趋势和侵蚀。ECM为机构出示构造适用,与细胞和别的ECM部件发生物理相互作用,并在根据整联蛋白和细胞表层蛋白激酶融合后转导数据信号。人的大脑ECM约占人的大脑总容积的17–20%,且关键由HA,蛋白聚糖(比如lectican大家族)和糖蛋白(比如腱糖蛋白,酸碱性分泌蛋白和饱含胱胺酸)构成(SPARC)和血细胞反应蛋白-1(TSP-1))。脑本质ECM成份存有于GBM栽培基质中,但具备不一样的表述方式。因为GBM中活跃性的毛细血管形成,GBM栽培基质中的别的ECM成份包含玻连蛋白,骨桥蛋白和血管ECM成分。BBB的血管基底膜(BM)显示出与脑实质或肿瘤基质完全不同的ECM成分。BBBECM缺乏HA,主要由IV型胶原蛋白,层粘连蛋白,尼古丁(也包括entactin),perlecan,纤连蛋白和玻连蛋白组成。脑实质,GBM(表1)和BBB(表2)中的主要ECM成分),以其结构特性,与其他ECM成分或细胞表面受体的串扰,GBM基质中的表达模式以及调节大脑活动,GBM进程或BBB特性的主要功能展示。在许多中枢神经系统疾病中,ECM的数量或组成都会发生变化,但是特定的相互作用以及它们在分子水平上如何调节大脑微环境仍然是一个积极研究的领域。机械特性(例如组织的硬度)与ECM的组成和组织有关。构建3D模型将在更现实的环境中增进我们对ECM的理解,从而能够识别驱动肿瘤转化的特定相互作用基础的新机制,因为可以在体外精确控制和隔离变量。

脑实质ECMHA是一种不带蛋白质核心的带负电荷的糖胺聚糖(GAG),是大脑中最丰富的ECM成分。及其负电荷吸引阳离子和导致的水渗透涌入,其中,除了其亲水性,导致高的保水能力。脑实质中的高HA水平以及I型胶原蛋白等纤维状蛋白的缺乏,使大脑成为具有显着可塑性的非常柔软的器官。正常的脑实质具有0.1-1kPa左右的弹性模量。在健康的脑,HA通常是在其高分子量形式存在,范围从1000至8000千道尔顿。HA非共价结合其他ECM组件,包括lectican家族蛋白聚糖。蛋白聚糖由具有不同GAG侧链的核心蛋白组成。排球菌是硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)的一个家族,其中包括versicans,aggrecans,neurocans和brevican。其他中枢神经系统CSPG包括磷酰胺和神经胶质抗原2。神经罐和短尾vic的表达主要限于中枢神经系统,而凡虫和聚集蛋白聚糖则在人体其他部位更普遍地表达。Versican有几种同工型;V2versican亚型是健康成人大脑中主要的CSPG。Lecticans被认为是CNSECM的组织者,因为它们可以与HA和Tenascin-R(TN-R)形成三元复合物,也就是CNS的神经周围神经网络。Tenascin-C(TN-C)和TN-R是CNS中发现的两种腱糖蛋白,分别由少突胶质细胞和星形胶质细胞产生。肌腱蛋白属于基质细胞蛋白(MCP)家族,它们是非结构性ECM蛋白,能够通过结合细胞表面受体和结构性ECM成分来调节细胞功能和细胞-ECM相互作用。中枢神经系统中另外两个重要的基质细胞蛋白是SPARC和TSP-1。TSP-1与内皮细胞表面的CD36结合以抑制血管生成。

GBMECMGBM的独特ECM(主要由HA组成)有助于GBS广泛侵入CNS,并限制了CNS外部极少的转移扩散。HA含量相关因素与GBM恶性肿瘤。在GBM基质中发现高和低分子量HA水平升高,而低分子量HA与血管生成,肿瘤进展和迁移有关。HA受体,CD44和RHAMM以及肿瘤细胞表面的整联蛋白促进细胞粘附至ECM并沿ECM迁移。肿瘤细胞与ECM的结合调节细胞运动性和蛋白酶产生,促进局部ECM的重塑。低分子量HA和HA片段通过在巨噬细胞上通过Toll样受体(TLR)(例如TLR4)传递信号并诱导M2样表型来参与免疫调节。GBM基质中许多蛋白聚糖的表达模式发生了变化。短尾螨,也称为富含脑的透明质酸结合蛋白,在GBM基质中升高,并参与GBM的生长和发展。V2versican亚型在GBM基质中被下调,而V0/V1亚型则与转化生长因子β2(TGF-β2)相互作用以促进肿瘤进展。GBM基质内细胞周围ECM中TN-C和SPARC的上调水平表明在血管生成中可能发挥作用。肿瘤细胞过度表达的TN-C也参与TAM激活,并与GBM硬度相关。TN-R在高级别神经胶质瘤中的表达减少,但其作用尚不清楚。已知具有抗血管生成作用的TSP-1在GBM基质中被下调,与GBMTME中的超血管形成相一致。骨桥蛋白是一种基质细胞磷酸糖蛋白,能够通过与CD44和整联蛋白相互作用来促进肿瘤进展和转移。在GBM微环境中骨桥蛋白的过表达诱导TAM中的M2表型,维持GSC的干性,诱导血管生成,并增强肿瘤细胞迁移。纤连蛋白和玻连蛋白,其是BM的部件,也被过表达在GBM,报告给调节肿瘤细胞粘附力,内聚力,和侵袭,并激活的小胶质细胞。总体而言,ECM组成和表达水平的变化会随着GBM的生长和浸润而产生积极的反馈,从而导致肿瘤快速进展和不良预后。

GBM患者的肿瘤基质,浸润性边缘和非肿瘤性脑实质内ECM的不断重塑导致微环境机械性能的可检测变化。肿瘤基质的硬度范围为至26kPa,GBM患者的非肿瘤脑区域的硬度为±2.1kPa,比健康大脑的硬度大得多。

BBBECM主要的BBBECM网络是由形成IV型胶原和层粘连蛋白的非原纤维网络形成的,并由尼古丁和蛋白聚糖稳定。BM通常采用厚度为50–100nm的有组织的ECM薄板形式。胶原蛋白IV是血管BM的主要结构元素,具有由三条α链组成的三聚体结构,为BM提供结构支撑并保持BBB的完整性。层粘连蛋白是由α,β和γ链组成的三聚体蛋白。BMEC,周细胞和星形胶质细胞合成不同的层粘连蛋白同工型,导致层粘连蛋白同工型在包埋的周细胞两侧的血管BM中差异分布。内皮细胞的BM富含BMEC和周细胞合成的层粘连蛋白411和层粘连蛋白511,而实质细胞侧的ECM富含星形胶质细胞主要合成的层粘连蛋白211。内皮层粘连蛋白的整体敲除会诱导胚胎致死,而α2或β1亚基的缺乏会导致血脑屏障破坏和通透性增加。BMEC和周细胞合成的层粘连蛋白同工型不能补偿层粘连蛋白211的损失,这可以解释为什么星形细胞层粘连蛋白不足时会发生严重的BBB分解。另外,整联蛋白结合层粘连蛋白并调节紧密连接形成和BBB的渗透性。Perlecan是一种大型硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG),可与包括Edogen在内的许多ECM蛋白结合,如果缺乏则可诱导胚胎致死性。Nidogen和perlecan在BBB完整性中的确切作用仍在研究中。纤连蛋白和玻连蛋白的水平与受损的血脑屏障和小胶质细胞活化有关,但尚不清楚它们的其他功能作用。

生物3D打印策略概述3D生物打印是一种增材制造技术,能够根据计算机辅助设计(CAD)模型制造用户定义的3D对象。可以从临床图像(例如磁共振成像(MRI)扫描或计算机断层扫描(CT)扫描)重建CAD模型,或者使用CAD软件进行设计,以针对特定应用提供特定的几何形状。3D模型被分成一系列具有预定层厚度的2D横截面切片,由生物打印机实施。3D生物打印过程可在所有三个维度上生成定义明确的结构,其高分辨率,可重复性,灵活性和可定制性使其成为广泛的生物学应用的有力工具。为了成功地对生物样品进行建模,生物打印模型的仿生术需要使用性能匹配的生物材料,并结合相关的细胞类型和其他分子。主要的生物打印方法包括基于喷墨的,基于挤出的和光辅助生物打印过程的优点,限制和重要的生物打印方法的特征总结于表4。无论采用哪种生物打印方法和生物材料,都可以成功构建细胞封装的组织和疾病模型,用于筛选或递送药物的生物平台以及无细胞支架。基于喷墨的3D生物打印基于喷墨的生物打印通过从喷嘴沉积体积受控的生物墨水液滴来形成3D结构。喷墨生物打印使用热,压电或静电机制将液滴沉积到接收基材上(图3a)。在热喷墨生物打印中,局部加热产生的气泡从喷嘴喷出液滴。即时加热基本上不会影响细胞活力。压电和静电方法分别利用从压电致动器产生的压力或压力板的偏转来喷射液滴。喷墨生物打印可提供简单,低成本,快速打印速度和高分辨率,而不会牺牲细胞活力。然而,对于该印刷方式,细胞密度需要保持在1百万细胞mL-1以下,以减轻剪切应力,该剪切应力可能降低分配期间的细胞生存力。对于这种打印方法,在目标分辨率,材料粘度,喷嘴尺寸和分配速度之间取得平衡至关重要。使用较小直径的喷嘴可以产生更好的分辨率,但是如果材料粘度不合适,则还会增加堵塞的可能性。低于12mPas的低粘度生物材料与喷墨打印兼容。使用喷墨生物打印,已证明了广泛的生物学应用,包括癌症模型,干细胞研究,组织工程,单细胞研究,细胞阵列模式,和分子的控释。喷墨生物打印还可以通过包含多个喷嘴来实现高产量,这使其成为筛选应用程序的理想选择。

基于挤出的3D生物打印基于挤出的生物打印依赖于材料细丝通过喷嘴的连续沉积。与喷墨生物打印相比,连续过程使它能够生成整体界面更好的结构。基于挤压的生物打印的两种主要分配机制是基于气动的和基于机械的。后者包括活塞驱动和螺杆驱动方法(图3b)。在打印过程中,将载物台或充满生物墨水的分配喷嘴电动化,以逐层方式创建3D结构。气动分配通过压力变化直接控制,使其高度灵活;同时,压力变化的延迟会降低其在沉积生物墨水空间控制中的精度。由于对物料流具有实时影响,因此机械分配方法通常在空间控制方面更好,而螺杆驱动系统特别适用于高粘性物料。挤出生物打印的多功能性使其可与多种生物材料兼容,粘度范围为30至6×107mPa·s。这种印刷方式还允许以相对高的密度以椭球形的形式封装细胞。尽管在喷嘴内会发生的是,剪切应力,基于挤出的生物打印方法允许在印刷构建体具有较高细胞活力。基于挤压的生物打印的分辨率受到一些因素的限制,包括喷嘴直径,胶凝动力学以及生物墨水的性质和组成。尽管脱细胞支架可以实现5μm的高分辨率,但细胞包封的样品的分辨率通常受到损害,通常超过100μm,作为扩大规模潜力和高封装能力的折衷方案。然而,基于挤出的生物打印是用于组织工程应用的最广泛使用的生物打印策略,因为它产生具有生理学相关尺寸,机械性能,和细胞密度的样品的能力。

光辅助3D生物打印光辅助生物打印使用光子能量来诱导生物墨水的光聚合,从而形成3D结构。光辅助策略在所有三个维度上都具有高分辨率和对体系结构的精确控制。如果没有在喷墨或挤出生物打印中发生的高剪切压力,则使用光辅助生物打印方法,即使对于包括干细胞在内的敏感细胞类型,也可以实现更高的细胞活力。可以根据制造过程对光辅助生物打印进行分类:基于扫描和基于投影。基于扫描的策略通常需要沿所有三个轴连续移动。首先,通过扫描生物墨水内或供体膜上的激光束,在一层上形成2D特征。激光束然后沿着第三轴移动,通常是z轴,以建立3D结构。基于投影的生物打印一次聚合整个层。一个平面上的特征由图案光的单个投影形成,因此在打印过程中通常仅需要沿着第三轴移动电机。因此,与基于扫描的策略相比,基于投影的策略通常可提供更高的吞吐量和更快的打印速度。

在生物应用中常用的光辅助方法包括:

1)基于扫描的策略,例如基于激光辅助的生物打印(LAB)和基于双光子聚合(TPP)的生物打印;

2)基于投影的策略,主要是基于数字光处理(DLP)的生物打印。激光辅助生物打印机由脉冲激光源,接收基板和碳带组成,碳带由生物墨水层和通常由金或钛制成的金属激光吸收层组成(图3c)。在印刷过程中,激光脉冲在供体层上引起蒸气气泡,进而将生物墨水的液滴平行于色带喷射到接收基板上。具有高细胞密度的微米级结构已被印刷,并且多种材料都与该策略兼容。TPP是基于激光的直接写入策略,它使用超快激光束(例如飞秒脉冲)来逐层跟踪和聚合3D结构的横截面特征。TPP通过同时吸收近红外飞秒脉冲激光中的两个光子来聚合生物墨水(图3d)。TPP的分辨率不受光源衍射极限的限制,因此可以实现亚微米级的功能。使用TPP的聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)印刷了1μm或更小的精细特征。相对较高的分辨率使其适合生物材料的精细构图和单细胞研究,但需要权衡较慢的生物打印速度和可扩展性的限制。

DLP生物打印是一种基于投影的快速立体光刻,可以在几秒钟到几分钟内制造毫米或厘米级的构造。DLP打印机通常配备数字微镜设备(DMD)芯片,电动载物台或生物打印探针,一组光路以及计算机,以将载物台或探针的移动同步到相应的图案(图3e))。DMD芯片包含数百万个微镜,可以独立打开或关闭这些微镜,以显示具有微米级功能的用户定义图案。光可固化生物墨水仅在DMD芯片投射光的位置聚合,从而可以实现分辨率为2μm的高清晰度架构。通过这种生物印刷策略已经生产出整合多种细胞类型和多种ECM材料的功能性组织构建体。实现了高细胞活力,包括干细胞衍生的细胞。DLP生物打印允许对材料性能,如弹性模量和生化线索,这是生物学研究的重要方面的量的精确控制。许多生物材料已用于DLP生物打印,包括HA,明胶,脱细胞的ECM,丝素蛋白,聚乙二醇(PEG),PEGDA和聚氨酯(PU),而有些则需要进行修饰以获得光敏性。DLP的广泛的生物学应用包括控制生长因子的释放,神经再生,高通量药物测试,和组织和疾病建模。甲DLP基于体积3D生物打印策略,命名为计算机轴向光刻(CAL),使整个三维结构的制造通过与同步图案的突起bioinks的一个完整旋转(图3F)。该策略依赖于CT重建的反投影算法。与先前使用场干扰的尝试相比,此实现可提高几何灵活性,从而使其能够打印复杂的非对称3D结构。为了避免使用支撑材料,使用了粘度高达90000mPas的材料。这种策略具有许多独特的优势,例如能够在现有对象周围进行打印,并且具有可伸缩性,从而可以在一分钟内制造出厘米级的结构。

生物材料仿生3D模型要求具有良好生物相容性和组织特异性的生物材料,包括适当的生物物理/生化特性和降解动力学。生物材料形成促进细胞粘附,增殖和迁移的结构网络,并提供特定的时空线索来调节细胞行为。在这里,我们按照与大脑微环境的相关性以及3D建模和3D生物打印的适用性的顺序讨论生物材料(表3)。生物材料的两个主要类别包括:1)天然材料,它们是天然组织ECM的组成部分,以及2)具有良好生物相容性的合成材料。天然材料与生俱来具有生物相容性和生物活性,具有生化和生物物理特征,可导致出色的仿生效果,并且可以通过自然降解机制进行改造或清除。替代地,合成材料具有确定的化学结构和可调性质,但是缺乏先天的生物活性或生理降解机制。但是,可以对合成材料进行修改,以掺入粘附肽或可裂解的接头,以模仿天然ECM的功能或结构特性。3D建模通常结合多种生物材料来利用每个单独组件的集体特性。

为了清楚起见,我们将适用于生物印刷过程的生物材料称为生物墨水。开发具有良好可印刷性和仿生性的生物墨水对于3D生物打印应用至关重要。生物油墨的可印刷性包括各个方面,例如粘度,热敏性和光敏性,这取决于特定的生物印刷方式。另外,流变性质,交联机理和动力学以及印后机械性质,例如弹性模量和溶胀率,是生物油墨的重要参数。为了增强仿生效果,生物墨水通常与细胞,生长因子,细胞因子和其他分子结合在一起,以适应特定的生物学应用。天然生物材料及其衍生物

透明质酸HA是交替组成的带负电荷的,线性多糖d-glucuronic酸和N-乙酰基-d-葡糖胺,在神经元和神经胶质细胞的细胞质膜合成。由于HA在大脑和GBM基质中占主导地位,并且通过与细胞和其他ECM成分的相互作用在调节各种生理和病理过程中起着至关重要的作用,因此基于HA的水凝胶是模拟大脑组织和骨骼的最相关基质材料。脑肿瘤。HA水凝胶具有纳米孔结构和一定范围的弹性模量,可重现大脑和GBM基质。HA已与多种生物材料结合,包括I型胶原,甲基丙烯酸明胶(GelMA),壳聚糖,层粘连蛋白,纤维蛋白,和PEG制造3DGBM模型。HA显示出大小依赖性的调节行为,因此在设计特定模型时应考虑HA的分子量范围。超过1000kDa的HA适用于对健康的大脑组织进行建模,而在GBM基质中观察到分子量较低的HA会影响GBM的进展和迁移。通过固定一系列HA–GelMA水凝胶的多孔弹性,与较高分子量的HA(500kDa)相比,较低分子量的HA(10和60kDa)导致更高的侵袭性。HA的分子量不影响HA–GelMA水凝胶的弹性模量。所有组的测量值均在3kPa左右。由HA,层粘连蛋白和纤维蛋白制成的支架支持人类神经前体细胞(NPC)的生长和血管形成。

先前已审查了化学修饰以生成适合3D建模或3D生物打印的HA衍生物。修饰通常靶向上的羧酸基团d-glucuronic酸部分,在N-乙酰基N-乙酰基d-葡糖胺部分,和在两个部分的羟基。HA衍生物通过自由基聚合形成水凝胶。例如,在N-乙酰基d的C-6羟基上用甲基丙烯酸缩水甘油酯或甲基丙烯酸酐官能化的HA葡糖胺可形成甲基丙烯酸缩水甘油酯HA(GMHA)或甲基丙烯酸HA(MeHA)可在光引发剂(例如苯基-2-4,6,3-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP))存在下光聚合形成水凝胶。GMHA和MeHA由于具有快速的光聚合能力,因此是适合光辅助生物印刷的生物墨水。肝组织和GBM模型已使用基于GMHA的水凝胶混合物进行生物打印的MeHA也被官能化与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽,以促进细胞粘附到3D矩阵。形成基于HA的水凝胶的另一种方法是通过加成和缩合反应。HA硫醇衍生物在没有引发剂的情况下通过在空气中形成二硫键自发交联,使其成为用于挤出或喷墨生物打印的良好生物墨水候选物。醛,二酰肼和卤乙酸酯改性的HA通过加成和缩合反应形成生物相容的水凝胶。

明胶明胶是胶原蛋白的部分水解产物。明胶及其衍生物因其固有的生物活性特征(包括整合素结合的RGD序列和MMP消化位点)而被广泛用于3D组织建模。与单独培养的肿瘤细胞或PVN细胞相比,在3D明胶基质中共培养血管周围小生境(PVN)细胞和GBM细胞的水平更高,血管生成和ECM重塑。由于良好的流变性和热响应特性,基于明胶的材料是用于基于挤压的生物印刷中的流行生物油墨。明胶水凝胶已经实现了肝细胞的封装,并且经过3D打印的组织在培养两个月后仍保持活力和功能。明胶还可以与合成材料(例如PU)结合使用,从而在更长的生物打印窗口和更高的分辨率方面提高其可印刷性。明胶-PU基质使MSC具有较高的生存能力和增殖能力。GelMA是明胶的多用途衍生物,在3D生物打印中也很流行。GelMA是通过用甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯侧基修饰赖氨酸和羟基而开发的,从而使预聚物GelMA生物墨水在紫外光照射下在光引发剂的存在下可光聚合。GelMA保留了明胶的生物学特性,并使3D矩阵具有可调的机械性能。GelMA可以用作基础基质材料,以促进脑相关研究中其他功能性ECM(例如HA)的研究。通过将基于明胶的基质与不同量的可溶性或固定化HA混合,研究了HA的生化线索对肿瘤生长的影响。当HA浓度在%至%之间时,血管生成标记物和缺氧标记物的表达显示出双相峰。基于GelMA的水凝胶可产生HA,交联密度和GBM细胞密度的梯度。在空间上分级的基质揭示肿瘤细胞增殖和促血管生成的表达与局部交联密度和肿瘤细胞密度相关,而局部MMP2表达与细胞密度成反相关。GelMA也已与PEGDA结合使用以产生用于治疗心肌梗塞的心脏贴剂。

胶原蛋白胶原蛋白是大多数人体组织中普遍存在的ECM成分。尽管大脑实际上不存在I型纤维状胶原,但血管基底膜富含IV型胶原和一些V型胶原。因此,源自胶原的生物材料适合用于BBB的建模。但是,由于对GBM的胶凝机理研究充分,各种GBM研究都利用了胶原蛋白生物材料,包括基于pH和基于温度,丰富的细胞结合位点以及可调节的机械性能,以满足组织的特定要求。GBM细胞在3D矩阵中按胶原类型采用不同的形态:IV型为圆形,I/III型为纺锤状。胶原蛋白通常与其他生物材料结合使用,包括HA,琼脂糖和合成材料,以进行组织建模。在具有HA的混合基质中,只有IV型胶原而不是III型胶原支持GBM细胞增殖。纯胶原蛋白溶液具有相对较慢的胶凝过程和低粘度增加。预聚物溶液中胶原蛋白的浓度或包括核黄素的含量可提高生物打印的准确性包含核黄素可增加胶原蛋白生物墨水的储能模量,改善可印刷性。胶原蛋白生物墨水的胶凝通常是热控制或pH驱动的,而胶原蛋白生物打印已用于组织工程应用,包括心脏再生和肝脏建模的水凝胶的弹性模量可在和千帕,这是适用于脑组织之间定制。

脱细胞ECM(dECM)dECM是通过去除组织的所有细胞成分,同时保留大多数组织特异性和患者/宿主特异性的ECM结构和成分,并保留有利于细胞生长的天然ECM线索而获得的。对GBM患者脑组织衍生的dECM的分析表明,加工后GAG,HA,IV型胶原,层粘连蛋白和纤连蛋白没有受到明显干扰,因此适合作为体外建模生物材料。患者脑部dECM已与胶原蛋白混合在一起,以通过基于挤压的生物打印实现更好的凝胶化。与胶原蛋白对照中的细胞相比,在基于dECM的患者基质中,已扩散的单细胞具有异质和圆形的形态。此外,基于dECM的基质中的GBM细胞表达增加的基质重塑蛋白MMP9和HA相关基因,包括Hyal1,Hyal2,HAS2和CD44。尽管基于dECM的水凝胶的缓慢凝胶动力学常常需要将dECM生物墨水与其他生物材料整合以改善可印刷性,但最近的研究仅诱导了dECM生物墨水的热凝胶化。基于dECM的生物墨水已开发用于各种组织,例如软骨,心脏,脂肪,肝脏和肿瘤,并在基于挤出和基于DLP的生物打印机上显示出良好的可印刷性。然而,DECM通常是从一个个体的组织衍生的并含有多种天然蛋白质和多糖的,所以变化是不可避免的,在特定的变量控制是有挑战性的。尽管存在局限性,但dECM具有针对个别患者进行GBM建模的潜力,仍然是精密医学应用中生物材料的绝佳选择。

基质胶基质胶是可热固化的ECM成分的混合物,其成分来自鼠类Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤,由约60%层粘连蛋白,30%IV型胶原蛋白,8%胶原蛋白,其他生长因子和蛋白聚糖组成。它与血管ECM成分的相似性使其特别适合BBB建模。因此,Matrigel被广泛用于体外血管形成和相关研究。GBM类器官也已在Matrigel中开发,类器官中的细胞显示出低氧梯度以及茎和增殖的异质性。但是,尽管许多研究表明GBM细胞具有良好的生存能力和在基质中的增殖,但Matrigel中的大多数蛋白质在大脑中的含量很少(BBB除外)或GBM,使其成为GBM建模的次佳选择。Matrigel的局限性包括其动物起源,降低实验可重复性的批次变化以及对形成的3D基质的物理化学性质的有限控制。由于其相对较差的机械性能和缺乏光敏性,Matrigel的可印刷性也受到限制,因此它经常与其他生物材料(例如琼脂糖,藻酸盐和明胶)结合使用3D生物打印技术来制造支架或组织模型。

纤维蛋白纤维蛋白是通过纤维蛋白原和凝血酶的交联形成的。纤维蛋白水凝胶的机械性能主要取决于纤维蛋白原的浓度,而在较小程度上取决于凝血酶。血纤蛋白基质可实现至4kPa的硬度,这是脑部应用的相关范围。GBM球蛋白和纤维蛋白基质中的内皮细胞的共培养模型已用于测试抗血管生成化合物。与没有VEGF或VEGF胶原蛋白水凝胶的纤维蛋白基质相比,负载有血管内皮生长因子(VEGF)的纤维蛋白水凝胶支持神经干细胞的生长和迁移,证明了纤维蛋白基质嵌入生长因子以延长培养时间的有益特性。同样,在纤维蛋白基质中培养的具有细胞毒性的人MSCs观察到改善的细胞增殖和持久的持久性,从而使基于MSC的GBM治疗能够抑制术后复发。基于纤维蛋白的生物墨水在基于挤压的生物打印中很流行。纤维蛋白生物墨水已与明胶,藻酸盐或HA混合以改善其机械和生化特性,并生成了各种组织模型,包括GBM模型,心脏组织和牙本质-牙髓复合体。

其他对于CNS研究,还探索了并非大脑天然存在但具有良好生物相容性和可印刷性的其他天然生物材料。丝素蛋白(SF)已用于神经网络的形成,而结冷胶已用于多层神经回路的形成的SF水凝胶的硬度的范围和GG水凝胶适合于建模GBM基质。人类GBM细胞系在两种类型的SF水凝胶中表现出不同的反应-增强的活力和无规卷曲型细胞的增殖以及诱导的结晶型细胞凋亡。具有可调机械性能和印刷后降解速率的SF水凝胶也可以适应不同的生物印刷应用。天然肿瘤基质或BBB中存在的其他非网络形成的ECM成分可与上述水凝胶形成的生物材料一起掺入3D基质中,以在未来的研究中改善材料的仿生性。合成生物材料尽管非生物来源,但合成生物材料可以很容易地进行修改,以具有机械和生物化学上强大的特性以及用于生物建模的降解动力学。通过使用细胞粘附肽和MMP可切割序列进行功能化,或与其他天然生物材料混合,基于合成生物材料的水凝胶可以创造出与天然生物凝胶具有可比性的微环境。基于合成生物材料的模型由于其合成性质,通常具有良好的可伸缩性和可再现性。除细胞封装模型外,合成材料还适用于制造细胞培养支架,微流控设备或可植入设备。在聚苯乙烯支架上培养的GBM细胞对于TMZ,厄洛替尼。

合成聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm),PEG和PU是用于GBM研究的合成生物材料。PNIPAAm及其复合材料是热响应水凝胶,在基于挤出的生物打印机上显示出良好的可印刷性。嵌入金纳米棒的PNIPAAm可以用多光子光刻技术印刷,以实现纳米级分辨率和后印刷动态调制。在PNIPAAm-PEG基质中培养的主要GSC在长期培养过程中仍保持茎干状态,可以通过调节水凝胶的温度轻松回收和重新封装。水凝胶可将GSC扩增为筛选目的所需的大量。PEG因其良好的生物相容性,惰性的生化特性和可调节的机械特性而成为3D组织建模的流行生物材料。PEG及其衍生物可以很容易地用生物活性成分进行修饰,以增强其仿生性和作为生物墨水的可印刷性。PEG水凝胶与HA的固定浓度混合,并用RGD肽和MMP降解交联剂官能已被用于研究对GBM进展的刚度的影响。与在较软结构(1kPa)中的细胞相比,在坚硬的PEG水凝胶(26kPa)中培养的GBM细胞形成更致密的肿瘤球体。PEGDA是PEG的衍生物,由于其生物相容性和光聚合性,已在3D生物打印中得到广泛应用。PEGDA已被用于形成微孔,用于胶质母细胞瘤细胞的体外培养或胶质母细胞瘤细胞与内皮细胞的共培养,以进行高通量药物筛选。PU水凝胶是温敏和生物可降解的。通过3D生物打印嵌入水基PU水凝胶中的神经干细胞具有出色的生长和分化潜力。

自组装肽(SAP)基于SAP的水凝胶通过肽的物理或化学键交联,形成类似于天然ECM结构的有组织的纳米纤维β-折叠层。肽是具有先天生物学特性的氨基酸链。纤维状SAP水凝胶具有可调的机械性能和可控的刺激响应胶凝过程(例如,酶促触发),使其成为可用于基于挤出的生物印刷的生物墨水。荧光SAP水凝胶的证明的概念基于挤出的印刷表现出良好的机械稳定性和在溶液中较低的侵蚀速率。SAP的可注射性及其适应不规则形状的能力也使其成为CNS再生的良好候选者,例如GBM手术后的BBB修复或脑组织修复。刚度在26和5.336kPa之间的肽RADA16-SVVYGLR形成水凝胶被注入斑马鱼脑损伤模型的大脑中,可诱导血管生成和神经发生。

GBM和BBB的生物3D打印

用于GBM建模的3D生物打印3D生物打印已经成为一个有前途的工具,建模和各种癌症类型,如乳腺癌发展的治疗,胰腺癌,肝癌,卵巢癌和转移模型。3D生物打印能够制造具有活细胞和生物材料的复杂3D架构的能力使其特别适合概括异质GBMTME。利用工程生物材料和细胞类型开发了3D生物打印的GBM模型,适用于不同的应用,例如机理研究,细胞-基质相互作用,特定壁ches内的细胞串扰,治疗评估或用作筛选平台。虽然对于模拟早期ECM环境的工程材料的选择可能相对有限,但已经对各种细胞类型进行了深入研究并可供使用。在每项研究中选择细胞类型的基本原理都是合理的,因此在我们的综述中,使用细胞组成对这些模型进行分类。在这个部分,表5)基于它们的细胞复杂性并提供关于它们可能解决的生物学问题类型的观点。

单培养3D生物打印GBM模型单培养3DGBM模型非常适合研究肿瘤与ECM的相互作用和机理研究。GSC已通过基于多喷嘴挤压的生物打印机被封装在明胶-海藻酸盐-纤维蛋白原(GAF)水凝胶中(图4a)。明胶,藻酸盐和纤维蛋白原分别通过转谷氨酰胺酶,氯化钙和凝血酶依次交联,以实现高印后细胞活力和增殖。与悬浮培养的对照组相比,在3D培养的GSC中检测到血管生成调节剂和干性标记物CD31,VEGFR2,HIF-1a和CD133的水平升高(图4b))。在3D培养的GSC中观察到形态学变化,包括内质网和线粒体含量更高,微绒毛数量增加(图4c),这在肿瘤细胞存活中起着重要作用。使用相同的基于挤压的方法和GAF水凝胶对患者来源的GSC和神经胶质瘤细胞系进行了生物打印的GSC表达VEGF的水平升高释放肿瘤细胞在体内触发血管生成和表现出对治疗TMZ较高电阻相比2D培养对照。富含3D水凝胶的干细胞群体表达了干性标记CD133和Nestin(图4d)。上皮-间充质转变(EMT)增强,与非GSC向GSC的转变有关,发生在扭曲和蜗牛水平增加的3D模型中(图4e)。与2D培养细胞相比,源自3D模型的GBM细胞显示出更高的体内致瘤性(图4f)。由于基质细胞和肿瘤细胞之间缺乏细胞相互作用,单培养3DGBM模型不是最佳的,使用的生物材料可能不是GBM基质的主要天然ECM成分。但是,单一培养3D模型可以使肿瘤细胞与天然维数矩阵内的天然ECM成分相互作用。与传统培养的对照相比,基质或维度诱导的基因表达和细胞形态的变化导致3D培养细胞的血管生成和干性标记表达升高,EMT增强以及耐药性更高。

共培养3D生物打印GBM模型共培养3D生物打印的GBM模型已用于在仿生3D环境中研究肿瘤细胞与基质细胞(例如巨噬细胞,MSC和EC)之间的特定细胞相互作用。用基于挤出的GelMA-明胶生物墨水的生物打印技术制成的微型大脑(小脑)用于研究小鼠GBM-巨噬细胞的相互作用(图5a)。为了研究巨噬细胞和GBM细胞之间的串扰,对大脑部分进行了小鼠巨噬细胞的生物打印,并在腔中填充了小鼠GBM细胞(图5b)。观察到巨噬细胞向GBM细胞募集和巨噬细胞极化(图5c)。与2D对照相比,细胞在3D共培养模型中表达了基质重塑标记物,TAM特异性标记物和GBM特异性标记物(图5d–f)。还通过共培养用单个细胞类型制造的小脑研究了旁分泌信号传导。在小脑系统中培养的GBM细胞表现出增强的间充质特征,波形蛋白(Vim)的表达和E-钙粘蛋白(Cdh1)的表达水平降低。用小脑评估了靶向增殖的GBM细胞或巨噬细胞的几种免疫调节和化学治疗化合物,并证明了其临床相关性(图5g)。为了预测特定患者的治疗反应,使用猪脑dECM(BdECM),患者来源的GBM细胞,人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和有机硅生物墨水,通过基于挤压的生物打印,开发了GBM芯片模型。环形肿瘤核心被封装在BdECM水凝胶中的HUVEC环包围。为了产生一个径向的氧梯度,在细胞部分周围印刷了一层可渗透气体的硅酮油墨,并且一层不渗透气体的玻璃覆盖了整个印刷结构的顶部,因此氧只能在穿过硅酮后到达肿瘤核心层和HUVEC层。BdECM保留了富含HA的大脑ECM微环境的大多数生化线索,并显示出在增强细胞行为方面的优越性。GBM细胞表达更高水平的促血管生成标记,并增加增殖和侵袭。与胶原水凝胶中的HUVEC相比,HUVEC在BdECM中表达的血管生成标记更高。在共培养模型中观察到低氧梯度和肿瘤细胞的增殖呈负相关。使用特定于患者的3DGBM芯片预测了不同的治疗阻力。

同轴挤压生物打印方法用于生产核壳管,其中藻酸盐-明胶生物墨水为壳,纤维蛋白原核包裹GSC和MSC。GSC和MSC在同轴模型中自发形成肿瘤纤维,并且肿瘤纤维表达高水平的Nestin,CD44和Vim。在对照组中,细胞直接与没有核壳结构的藻酸盐水凝胶混合,GSC和MSC不会自发相互作用,表明ECM在调节肿瘤-基质相互作用中发挥了作用。同样的同轴印刷方法被用于生产GSC和非GSC肿瘤细胞的核-壳结构壳由具有或不具有GSC的藻酸盐水凝胶和具有已建立的GBM细胞系的核心组成。在与GSCs共培养的GBM细胞系中,与GBM侵袭有关的基因表达模式(包括MMP2,MM9,VEGF2)升高。共培养的GBM细胞中还增强了耐药基因,包括TMZ耐药的调节子O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT),这表明GSC的存在可以增强非茎状肿瘤的侵袭性和耐药性细胞。

共培养3D模型是本机GBM微环境的简化版本。使用大脑dECM证明,生物材料的最新进展不仅可以对GBM进行建模,不仅可以使用相关的细胞类型,还可以使用相关的ECM组件,从而改善了生物模拟。共培养模型的局限性在于,细胞类型不会在天然TME中一对一地相互作用。但是,这些模型提供了机会,可以与其他相互作用隔离地询问特定的生态位相互作用,例如血管周围的生态位,免疫生态位或干细胞生态位。它们可以潜在地揭示特定细胞相互作用的潜在途径,并可以用于在仿生3D环境中筛选靶向GBM基质成分的治疗性化合物。

多细胞3D生物打印GBM模型多细胞生物打印3DGBM模型是由肿瘤细胞和多种基质细胞类型组成的GBM模型,具有适当生物材料的定义3D结构组织。多细胞模型是捕获高水平GBM异质性的体外模型。使用基于DLP的生物打印技术开发了人类多细胞GBM模型,概括了复杂的免疫相互作用和功能依赖性。除GSC以外,基质细胞,包括单核细胞/iPSC衍生的巨噬细胞或原代巨噬细胞,星形胶质细胞和NPC,均按空间分隔进行印刷。设计了封装肿瘤和基质细胞的GMHA–GelMA基质来模拟天然组织的硬度和HA含量(图6a)。具有巨噬细胞(四培养)或无巨噬细胞(三培养)的GSC形成了肿瘤核心,被模仿人脑实质的NPC和星形胶质细胞所包围。四次培养中的GSC比传统的球形培养物更好地概括了临床GBM肿瘤组织的转录谱(图6b)。将四次培养中GSC的基因表达谱与来自癌症治疗反应平台(CTRP)的药物敏感性数据以及癌症基因组图谱(TCGA)或中国神经胶质瘤基因组图谱(CGGA)中的患者生存数据相关联,从而可以预测药物敏感性和患者的预后。巨噬细胞在四联培养中促进了GSC的侵袭性,耐药性和低氧表达(图6c,d)。未分化的单核细胞,当在四培养模型中进行生物打印时,会自发地向M2巨噬细胞表型极化,而没有额外的外部刺激,表明基质细胞对多细胞TME有反应(图6e)。四培养模型被用作整个基因组CRISPR‐Cas9筛选平台,以发现新颖的功能依赖性和途径。在GSC球培养,3D生物打印模型和异种移植中,验证了由四培养模型指示的几个候选基因的单个基因敲除。具体地,通过敲除PAG1基因,观察到体外细胞存活力降低和异种移植物中的存活延长(图6f,g)。

另一种基于多喷嘴挤压的生物打印方法被用于在基于藻酸盐的水凝胶中生成具有GBM细胞系或GSC,患者来源的GBM相关基质细胞(GASC)和小胶质细胞的3D模型。海藻酸盐用RGDs官能化,在某些组中用HA和胶原蛋白官能化。3D多细胞模型显示出对TMZ的耐药性适度增强,对顺铂的耐药性增强,该化合物在许多临床试验中均未通过,但在2D培养中显示出可喜的结果,表明该系统可能用于更可靠的临床前药物疗效评估。

随着3D生物打印模型中集成了更多的细胞成分和生物材料,驱动肿瘤表型的分离因子变得越来越复杂,但随着异质性的提高,仿生性也会提高。通过在3D模型中启用多种细胞-细胞和细胞-基质相互作用,可以重现生理相关的肿瘤生长和侵袭模式,概括天然肿瘤转录组谱,提出个性化的治疗计划,并预测与临床结果平行的预后。这些具有高度仿生性和异质性的模型有望在体外平台上用于可重现,可靠和高通量的药物筛选和CRISPR筛选,从而在更临床相关的环境中询问功能依赖性。用于BBB建模的3D生物打印功能性3DBBB模型应概括其生理水平可比的关键BBB特性。这种脑血管屏障的主要特征包括紧密性,完整性,选择性通透性和转运机制。为传统的体外BBB模型开发的各种检测方法可用于评估3D模型的属性。上皮/内皮电阻(TEER)实时定量测量紧密连接的完整性。可以通过BBB特异性连接蛋白和转运蛋白的表达来测量紧密性和转运机制,包括:1)紧密连接蛋白,例如claudins,occludins,zonulaoccludens-1(ZO-1),ZO-2和ZO‐3;2)转运蛋白,例如GLUT1,P-gp,BCRP和MRP。可以使用具有确定大小的荧光分子(例如葡聚糖和荧光素钠)评估通透性。

通过双光子光刻技术制造的生物杂交微流控设备植入了小鼠脑内皮细胞和GBM细胞(图7a)。在入口和出口之间平行制造了几个直径为10μm的管状结构,与脑微毛细管相当,通道壁上有1μm的孔(图7b,c)。数值模拟显示了微毛细管中均匀且生理相关的流速(图7d)。生物混合系统中的内皮细胞形成紧密连接并表现出屏障特性,这已通过ZO-1表达和右旋糖酐扩散证实(图7e))。与无细胞装置相比,在存在内皮细胞的情况下,TEER也增加。细胞接种后,沿微血管的多孔区域明显减少。

另一台BBB设备组装成三层3D打印的腔室,并在细胞膜上插入iPSC衍生的BMEC和星形胶质细胞,并在多孔膜的两侧培养以模仿BBB的天然结构(图8a,b)。在共培养的第3天测得的峰值TEER为4000Ωcm2,是体外模型中报道的最高TEER值之一,并且在体内值范围内(图8c)。用不同分子量的右旋糖酐和小的药物化合物测试的渗透性与临床数据相关(图8d)。

在挤压印刷的框架内结合EC和I型胶原制成的微阵列的BBB模型证明了BBB屏障功能(图9a–d)。培养两周后,紧密连接蛋白ZO-1的表达增加(图9e),并且从培养一周开始,血管内皮渗透性得到验证,并且没有40kDa右旋糖酐从血管中泄漏(图9f)。该模型允许对BBB的成熟进行时间依赖性的观察,其表现为紧密连接形成和BBB破坏/恢复。系统停留时间基于大脑中的实际血液停留时间,如果与GBM模型集成,则可以对化合物的渗透性进行临床相关评估。当前针对BBB的3D生物打印尝试主要是利用该技术开发的微流控设备更类似于天然解剖结构。与传统的微流体技术相比,3D生物打印的微流体技术的优势在于,可以通过3D打印精确且可重复地生产更复杂的几何形状,同时减少了操作时间和成本。未来GBM的治疗失败是由多种因素导致的,包括GBM微环境的高度遗传异质性,GBM的快速发展和固有的耐药性,以及由于BBB的阻隔性能,无法将治疗药物充分递送至GBM部位。GBM目前停滞不前的药物开发过程可以通过在临床试验期间降低新型化合物的损耗率以及开发针对不同GBM亚型的药物或治疗计划来改善。后者需要对GBM亚型的分子机制有更深刻的了解。药物消耗率高表明当前的临床前模型不足以提供临床相关的评估。对于体内GBM模型,缺乏物种匹配的细胞相互作用降低了它们在临床试验中预测治疗结果的有效性。对于体外3DGBM模型,功能性BBB尚未可复制地纳入,因此限制了其评估化合物渗透效率的能力,这也影响治疗效果。3D生物打印技术和生物材料工程技术的进步为开发集成的,仿生的和基于人的模型系统提供了与临床相关的建模能力。这些模型系统潜在地概括了物种匹配和组织特定的特征,例如其生理对应物的维度,组织,细胞间相互作用以及细胞间相互作用。定制的3D生物打印GBM模型可以概括患者肿瘤的细胞和ECM微环境,这将有助于阐明涉及GBM亚型的途径。集成的GBM-BBB系统可以消除在临床试验中失败但在静态2D培养,独立的体外模型或动物模型中显示出成功的化合物。将BBB和GBM的其他基质成分结合到ECM衍生的生物材料中的模型将能够同时评估药物对肿瘤细胞的治疗功效,药物跨BBB的渗透效率以及对肿瘤微环境中基质细胞的药物毒性。此外,整合模型可以重建肿瘤组织内部和周围的血脑屏障的非均质屏障特性,以模仿自然的生理特征,包括坏死肿瘤核心附近的受损血管和侵入性边界附近的完整血脑屏障。BBB沿增殖边界的完整性可保护高侵袭性和茎状GSC免受有效药物输送。表征不适用于当前的体外模型,但可以与整合模型一起考虑,包括:组织与血液的比率(TBR),与血液中的血液量相比,该化合物显示到达肿瘤的化合物的输送量,脑流出指数(BEI),显示药物通过血脑屏障后被泵回血液的可能性以及化合物渗透到肿瘤不同区域的可能性。BBB沿增殖边界的完整性可保护高侵袭性和茎状GSC免受有效药物输送。表征不适用于当前的体外模型,但可以与整合模型一起考虑,包括:组织与血液的比率(TBR),与血液中的血液量相比,该化合物显示到达肿瘤的化合物的输送量,脑流出指数(BEI),显示药物通过血脑屏障后被泵回血液的可能性以及化合物渗透到肿瘤不同区域的可能性。BBB沿增殖边界的完整性可保护高侵袭性和茎状GSC免受有效药物输送。表征不适用于当前的体外模型,但可以与整合模型一起考虑,包括:组织与血液的比率(TBR),与血液中的血液量相比,该化合物显示到达肿瘤的化合物的输送量,脑流出指数(BEI),显示药物通过血脑屏障后被泵回血液的可能性以及化合物渗透到肿瘤不同区域的可能性。基于集成GBM-BBB系统的评估还将使优化策略能够绕过BBB并增强新型化合物的递送和功效。总而言之,3D生物打印模型具有极大的潜力,可促进机理研究和临床应用,最终加速GBM治疗的进展。

在这里,我们对当前的3D生物打印GBM模型和BBB模型进行了全面回顾,涵盖了生物材料,生物制造技术,细胞类型,模型特征以及每种模型的适当应用。单培养GBM模型可以对细胞对ECM和尺寸的反应进行机理研究和研究。共培养模型允许研究肿瘤细胞与某些基质成分之间特定的细胞相互作用,并且是评估调节这些基质成分或其相关相互作用的疗法的良好工具。多细胞GBM模型在体外3D生物打印模型中捕获了最高水平的异质性和仿生学,因此具有更大的潜力,可以用作药物筛选平台或用于研究具有增强临床相关性的细胞依赖性的方法。除了总结3D生物打印GBM/BBB模型的最新进展外,本综述还为将来3DGBM和BBB体外模型的设计和实施提供了重要信息。信息包括两种天然微环境的细胞和ECM成分,在有机型建模中已证明成功的生物打印方法,以及用于大脑,GBM和BBB体外建模的相关生物材料。相关领域的研究人员可以参考本报告,以制定出最具成本效益的策略,以解决其特定的生物学问题。信息包括两种天然微环境的细胞和ECM成分,在有机型建模中已证明成功的生物打印方法,以及用于大脑,GBM和BBB体外建模的相关生物材料。相关领域的研究人员可以参考本报告,以制定出最具成本效益的策略,以解决其特定的生物学问题。信息包括两种天然微环境的细胞和ECM成分,在有机型建模中已证明成功的生物打印方法,以及用于大脑,GBM和BBB体外建模的相关生物材料。相关领域的研究人员可以参考本报告,以制定出最具成本效益的策略,以解决其特定的生物学问题。

然而,尽管其具有多种用途,包括多功能性,精确控制,生物相容性,可再现性和高生产量,但生物墨水开发和印刷技术的进一步发展对于实现生物印刷的广泛应用是必要的。尽管HA是GBM微环境中最丰富的ECM成分,但由于具有良好的可印刷性,已经开发了许多3D生物打印的GBM模型,其中均包含藻酸盐,明胶和GelMA水凝胶。由于HA的机械性能较差,基于挤出或基于喷墨的生物打印以高分辨率或结构完整性来打印HA结构仍然具有挑战性。令人鼓舞的是,基于DLP的生物打印技术最近在制造富含HA的多细胞GBM模型,许多研究表明,化学修饰可以改善基于HA的生物油墨在印刷中的流变性。开发新的生物墨水或对现有生物材料进行改性的方法,以改善其可印刷性,包括但不限于粘度和交联机理,以适应生物打印方式,将扩大用于生物打印的材料多样性,并最终增强3D模型的材料仿生性。对于BBB建模,3D生物打印可改善传统微流控系统的可定制性和通量,而3D生物打印BBB则具有改进的阻隔性能。迄今为止,该技术已主要用于促进随后植入细胞的设备制造。微米级结构,可灌注结构并且已经使用生物打印分别完成了细胞比对,这些功能的合并对于成功地BBB的细胞包封印刷是必要的。此外,还可以将通常用于类器官发育中的生长因子或小分子抑制剂的适当分子干预措施引入到后印细胞构建体中,以促进所需的细胞活动,例如BBB紧密连接的形成。

最后,我们认为应该为3D生物打印模型建立基准,包括标准化数据分析和模型属性评估,以确保其临床相关性并为将来的模型设计提供指导。3D模型被认为是传统2D模型和动物模型的有前途的替代品,其优点包括结构明确,组成合理,生产时间较短,物种匹配的模型(可提供更可靠的临床前数据)。从理论上讲,包含尽可能多的组件并以与天然生理学相当的方式组装它们,可以生成与原始组织结构相似的构造。但是,结构相似性是否引起功能相似性需要更严格的功能评估。应该为用于评估单个模型临床有效性和有效性的功能参数建立定性和定量标准,例如与临床数据的匹配和相关百分比。功能参数的示例是基因组和转录谱,药物反应以及每个单个组织的特定特征,例如BBB的屏障特性和GBM的侵袭性或肿瘤发生能力。利用收集的数据,对于研究团体而言,确定可以可靠地近似生理环境的最小组成部分和方面可能是有益的,从而减少了构建高度复杂的体外模型的成本和时间。应该建立用于评估单个模型的有效性和临床相关程度的功能参数。功能参数的示例是基因组和转录谱,药物反应以及每个单个组织的特定特征,例如BBB的屏障特性和GBM的侵袭性或肿瘤发生能力。利用收集的数据,对于研究团体而言,确定可以可靠地近似生理环境的最小组成部分和方面可能是有益的,从而减少了构建高度复杂的体外模型的成本和时间。应该建立用于评估单个模型的有效性和临床相关程度的功能参数。功能参数的示例是基因组和转录谱,药物反应以及每个单个组织的特定特征,例如BBB的屏障特性和GBM的侵袭性或肿瘤发生能力。利用收集的数据,对于研究团体而言,确定可以可靠地近似生理环境的最小组成部分和方面可能是有益的,从而减少了构建高度复杂的体外模型的成本和时间。以及每个单独组织的特定特征,例如血脑屏障的屏障特性以及GBM的侵袭性或肿瘤发生能力。利用收集的数据,对于研究团体而言,确定可以可靠地近似生理环境的最小组成部分和方面可能是有益的,从而减少了构建高度复杂的体外模型的成本和时间。以及每个单独组织的特定特征,例如血脑屏障的屏障特性以及GBM的侵袭性或肿瘤发生能力。利用收集的数据,对于研究团体而言,确定可以可靠地近似生理环境的最小组成部分和方面可能是有益的,从而减少了构建高度复杂的体外模型的成本和时间。